最近，医院、麻省理工学院、哈佛大学Ragon研究所和美国宾州大学佩雷尔曼医学院团队在Naturemedicine上共同刊发了一篇名为DualCD4-basedCARTcellswithdistinctcostimulatorydomainsmitigateHIVpathogenesisinvivo的文章。文章介绍了一种新型的可同时表达4-1BB/CD3-ζ和CD28/CD3-ζ刺激域的双CD4-CAR-T细胞在人源化HIV感染小鼠模型上的试验结果，发现该双CAR-T细胞能增强治疗被HIV感染细胞的效力，可能成为治疗HIV感染的有效方法，并给出了10条重要结论。
（来源：SMART）
临床前研究显示，CD28/CD3-ζ共刺激的CAR-T细胞具有显著的效应器功能，能够快速清除肿瘤，但在体内的持久性有限；相比之下，4-1BB/CD3-ζ共刺激CAR-T细胞的抗肿瘤反应较慢，但能持续增殖和存活。CD28和4-1BB所使用的不同的信号通路可引起不同的代谢、表型和功能性T细胞分化，为特定疾病诱导最佳的CAR-T细胞提供可能。
在该研究中，研究人员使用人源化小鼠模型进行了一系列试验，期望开发出一种基于CD4的CAR-T细胞来治疗HIV感染。为了增加效应器的功能，研究人员建立了一个双CAR-T细胞，它同时表达两个CD4为基础的CAR，分别编码4-1BB/CD3-ζ和CD28/CD3-ζ内域。这些双CAR-T细胞表现出CD28共刺激CAR-T细胞的细胞*性和细胞因子表达能力和4-1BB共刺激CAR-T细胞的增殖能力，表明这两种共刺激信号可同时起作用。研究人员也得出了如下10条重要结论：
1.来自BLT人源化小鼠的CAR-T细胞具有多功能性，在体外可抑制HIV的复制。
BLT是指骨髓（bonemarrow，b）、肝脏（liver,l）和胸腺（thymus,t）。研究人员将人骨髓、肝组织和胸腺组织导入已无自身免疫系统的小鼠体内，构建出获得人类免疫系统特征的小鼠，它们被HIV感染的方式与人类一致。通过比较扩张动力学和比较CAR表面表达水平，发现来自BLT小鼠的CD3-ζ内域（CAR.Tζ）细胞与来自人类的CAR.ζT细胞的体外功能特征没有明显区别，说明BLT小鼠可以制造出多功能的CAR.ζT细胞。
2.共刺激调节CAR-T细胞可在体内持续存活和起作用。
研究人员将CD3-ζ（CAR.ζ）、4-1BB/CD3-ζ(CAR.BBζ）和CD28/CD3-ζ（CAR.28ζ）T细胞分别与一个不同的荧光蛋白相连，然后注入到小鼠体内。他们发现4-1BB/CD3-ζT细胞在没有HIV抗原的情况下表现出最大的存活率，在组织中约占总CAR-T细胞的80%，这与在癌症领域的研究结论一致。相比之下，CD28/CD3-ζT细胞只表现出短暂的扩张，随后逐渐下降，而CD3-ζT细胞则稳定下降，没有扩张的迹象。通过向模型小鼠体内注入CD19特异性细胞，可以观察到血液中以及脾、肺、肝和骨髓中快速而严重的B细胞再生障碍，这与持续的CAR-T细胞*性反应一致。这些数据共同证明了共刺激在一定程度上可调节CAR-T细胞的活性。
3.4-1BB/CD3-ζT细胞不能控制艾滋病病*的反弹。
确定4-1BB/CD3-ζT细胞在体内具有良好的扩增和持久性后，研究人员试图其在抗逆转录病*疗法（ART）中抑制HIV感染的能力。研究人员使用HIV病*感染BLT小鼠，并在3周后启动ART。2周后，将ART抑制小鼠分为4组，2组接受4-1BB/CD3-ζT细胞，其中1组在输注后立即停止ART，另1组在3周后停止ART；另外2组接受无活性的对照4-1BB/CD3-ζT细胞，其中1组在输注后立即停止ART，另1组在3周后停止ART。结果显示，4组均表现为ART治疗被中断2周后病*出现反弹，并且严重程度上没有明显的差异。而且4-1BB/CD3-ζT细胞疗法不能防止外周血或组织中的记忆性CD4+T细胞被HIV感染和耗尽。这些数据表明4-1BB/CD3-ζT细胞治疗不能抑制HIV的增殖进展。
4.4-1BB/CD3-ζT细胞在HIV大量复制过程中表现出T细胞衰竭特征。
研究人员观察到4-1BB/CD3-ζT细胞在病*复发期间扩增，血液中的浓度平均增加了75倍，而对照组的T细胞没有在病*反弹后出现扩张。在输注12周后，4-1BB/CD3-ζT细胞在全身的分布更多。这些发现表明，4-1BB/CD3-ζT细胞控制病*血症和HIV发病的效果不佳并不是由其增殖不良、持久性差或缺乏迁移到病*复制相关部位所致。4-1BB/CD3-ζT细胞的扩散与包括PD-1、TIGIT和2B4在内的抑制性受体上调有关，这些受体含量随ART停止时间增加而增加。重要的是，这些抑制性受体在同一小鼠的内源性CART细胞上的表达程度不同，这表明CAR-T细胞具有特异性效应，而不是由炎症或病*载量导致的普遍性激活。随着HIV感染的进展，4-1BB/CD3-ζT细胞逐渐减少，最终形成了功能失调的HIV特异性CD8+T细胞，这与已有的研究发现一致。综合显示，4-1BB/CD3-ζT细胞能够识别被HIV感染的细胞，迅速扩张并上调细胞激活的标记物，但不受控制的病*复制最终会耗尽这一程序，这可能会降低T细胞的功效。
5.增强型双CAR-T细胞可减少急性感染时CD4+T细胞的丢失。
研究人员创造了一种以CD4为基础，且含有CD28共刺激域的4-1BB/CD3-ζ新型双CAR-T细胞（Dual-CAR-Tcells）。加入CD28共刺激域可增加4-1BB/CD3-ζT细胞在体外生成细胞因子的量。使用被HIV病*激发48小时的小鼠模型来检测治疗效果，发现尽管双CAR-T细胞治疗组和未治疗组之间的急性病*血症没有表现出差异，但是接受双CAR-T细胞治疗的小鼠在外周记忆CD4+T细胞（即CAR-）丧失方面表现出显著的（尽管是短暂的）延迟，这与外周血中总CAR-T细胞的峰值扩张相一致。值得注意的是，在接受4-1BB/CD3-ζT细胞治疗的小鼠停止ART治疗后，并没有在中枢、过渡性和效应记忆亚群中观察到CD4+T细胞丧失延迟现象。CD4+T细胞的保存在过渡期和效应记忆人群中尤为突出，效应记忆人群表达更高水平的CCR5，而CCR5是是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一。双CAR-T细胞治疗可以有效地限制HIV导致的记忆性CD4+T细胞的耗竭。
图
双CAR-T细胞结构示意（图右）（来源：Naturemedicine）
6.双CAR-T细胞在竞争环境中表现出旺盛的增殖能力。
通过将每个CAR与一个独特的荧光蛋白连接，可以实现每种CAR-T细胞类型独立的量化。研究人员发现相对于表达单一共刺激域的CAR-T细胞，双CAR-T细胞在体内有更高的扩增。研究人员将等量的双CAR-T细胞和第三代CAR-T细胞分别注入到受体小鼠中，发现双CAR-T细胞明显表现出更强的抗原独立性植入和优越的抗原驱动增殖。相比之下，第三代CAR-T细胞略有扩张，然后逐渐下降。并且研究人员观察到，与第三代CAR-T细胞相比，双CAR-T细胞在同一小鼠体内表现出了更高的增殖和长期存活。这些研究揭示了双CAR-T细胞在抗原稀缺和丰富的体内竞争环境下均表现出惊人的增殖能力。
7.HIV融合抑制剂C34-CXCR4可以保护CAR-T细胞免受HIV感染。
尽管基于CD4的CAR与其他几种基于HIV特异性抗体的CAR相比，能够更有效地抑制体外HIV复制，并且能降低病*逃逸的可能性，但这种基于CD4的CAR导致了T细胞表面CD4胞外结构域的过度表达，从而也增加了易感性。事实上，在体内检测到被HIV感染的CAR-T细胞由于与内源性CAR-T细胞无法区分所以无法判定总感染数。研究人员使用在表面表达的HIV融合抑制剂C34-CXCR4来处理双CAR-T细胞，使之获得抗HIV的能力。试验结果显示，C34-CXCR4融合抑制剂可以保护CD4-CAR-T细胞免受HIV感染，并且在持续暴露于HIV时,仍可以保持CAR-T细胞的功能。
8.抗HIV双CAR-T细胞可减轻HIV导致的CD4+T细胞减少。
为了确定在HIV感染期间双CAR-T细胞的注入是否表现出增强的病*特异性反应，研究人员向HIV感染小鼠体内注入了低剂量的C34-CXCR4+、纯化的双CAR-T细胞、4-1BB/CD3-ζT细胞或CD28/CD3-ζT细胞，并分为不同组。结果显示，双CAR-T细胞显示出对急性病*复制的显著敏感性，在感染后3周内，其扩增倍数为倍，占血液中人类细胞总数的30%，而4-1BB/CD3-ζT细胞和CD28/CD3-ζT细胞分别只有3%和1%。在HIV病*感染期间，输注纯化的双CAR-T细胞可最大程度地防止CD4+T细胞减少。此外，所有组的早期CAR-T细胞扩张的幅度与CD4+T细胞的保存呈正相关。这些数据表明，在控制CAR表面表达后，双CAR-T细胞显示出最大的体内抗病*作用。
9.双CAR-T细胞体外效应功能强过单一的4-1BB共刺激CAR-T细胞。
研究发现，双CAR和CD28共刺激的CAR-T细胞以相似的方式聚集在一起，CD4+的CAR-T细胞表达更多的TNF和IL-2，CD8+的CAR-T细胞上调更多的CDa和MIP-1β效应分子。相反，CD4+和CD8+4-1BB共刺激的CART细胞聚集在一起，并显示出减弱的效应分子水平。这些试验结果显示，双CAR-T细胞分别利用抗原驱动的增殖和4-1BB和CD28共刺激域介导的效应器功能来提高效力。
10.保护CAR-T细胞不受HIV感染可增强其对病*复制的控制能力。
研究人员比较了完全保护和部分保护的双CAR-TCP输注到HIV感染、ART抑制的小鼠体内，然后停止ART。结果显示，输注部分保护的双CAR-T小鼠的反弹后血液病*浓度高于未受治疗的小鼠血液病*浓度，更高于输注完全保护的双CAR-T的小鼠血液病*浓度。试验数据表明了保护CAR-T细胞的重要性，因为HIV感染未受保护的CAR-T细胞可能导致血浆病*血症，并可能压倒CAR-T细胞介导的对病*复制的控制。虽然C34-CXCR4减少了HIV病*对CAR-T细胞的感染，但试验已经证明，这种保护在持续病*血症存在时不能起效。研究人员尝试使用ART和双CAR-T细胞联合治疗，一周后显示联合治疗的小鼠比纯ART对照组的病*载量减少了大约1个对数，这对应于预处理水平的病*血症减少了50%。两项研究的数据汇总表明，早期病*载量减少的程度与同时期外周血中CAR-T细胞的浓度有关，并且CAR-T细胞治疗显著加速了HIV抑制，与ART治疗对照组相比，几乎所有接受联合治疗的小鼠在治疗开始2周后达到完全抑制HIV。此外，双CAR-T降低了血浆病*血症小鼠的组织负担，组织中感染HIV的CD8-T细胞（CAR-）和CD14+巨噬细胞均减少。值得注意的是，与对照组相比，从用双CAR-T细胞处理的小鼠中分类的中央记忆CD4+T细胞显示出HIV相关的细胞DNA负载显著减少，这表明CAR-T细胞疗法能够减少ART期间形成的病*库的大小。
这些发现突出了抗HIV双CAR-T细胞在体内直接介导抗病*和清除感染细胞的潜力。
